L'extraction et la purification des acides nucléiques sont essentielles pour un grand nombre d'études en biologie moléculaire. Le rendement et la pureté des acides nucléiques sont deux éléments importants pour assurer l'efficacité et la fiabilité des analyses.
L'objectif de l'extraction est donc d'isoler la molécule d'ADN, c'est-à-dire la séparer de tout les autres constituants d'un tissu, y compris les molécules fortement liées à l'ADN, et d'en obtenir un échantillon suffisamment pur et en quantité suffisante pour permettre toutes les manipulations de biologie moléculaire ...
L'acide désoxyribonucléique, ou ADN, est une macromolécule biologique présente dans presque toutes les cellules ainsi que chez de nombreux virus. L'ADN contient toute l'information génétique, appelée génome, permettant le développement, le fonctionnement et la reproduction des êtres vivants.
Ainsi, l'ajout d'éthanol ou d'alcool isopropylique (alcool à friction) fera se regrouper l'ADN qui formera un précipité blanc visible. Il est important d'utiliser de l'alcool froid, car il permet d'extraire une plus grande quantité d'ADN. Si l'alcool est trop chaud, l'ADN peut se dénaturer, ou se désintégrer.
La molécule d'ADN, également connue sous le nom d'acide désoxyribonucléique, se trouve dans toutes nos cellules. C'est le « plan détaillé » de notre organisme aussi appelé code génétique : il contient toutes les informations nécessaires au développement et au fonctionnement du corps.
Leur pureté est évaluée en mesurant l'absorbance à 280 nm et 230 nm. Le ratio 260/280 permet de détecter une contamination des acides nucléiques par des protéines. Sa valeur varie entre 1,8 et 2,0 pour de l'ADN et entre 2,0 et 2,2 pour de l'ARN. Le ratio 260/230 doit se situer entre 2,0 et 2,2.
Chaque être vivant en possède. La fonction de l'ADN est de stocker toutes les informations génétiques dont un organisme a besoin pour se développer, fonctionner et se reproduire. En résumé, il s'agit du manuel d'instructions biologiques présent dans chacune de vos cellules.
La PCR (Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérase en chaîne) est une technique d'amplification d'ADN in vitro. Elle permet d'obtenir un très grand nombre de copies d'une séquence d'ADN choisie.
L'ADN stocke l'information génétique à long terme.
Il transmet l'information génétique pour faire de nouvelles cellules. L'ARN quant à lui, est utilisé pour transférer le code génétique du noyau aux ribosomes, en vue de concevoir des protéines.
La protéinase K est utilisée pour le clivage des protéines dans les préparations d'acides nucléiques. Il est principalement utilisé dans la purification des acides nucléiques ou pour l'élimination des nucléases.
L'ADN est soluble dans l'eau
Les molécules d'eau ne sont pas chargées, mais elles sont polaires. Grâce à cette polarité, le côté le plus positif de l'eau peut se fixer au côté chargé négativement de l'ADN et le rendre ainsi soluble.
L'ADN (DNA) de plasmide (objet d'examen) est purifié à partir des bactéries E. Coli, par hydrolyse alcaline. Après purification, l'ADN plasmidique est soumis à des digestions par des enzyme de restriction. Sont aspect qualitatif est analysé par électrophorèse sur gel d'agarose.
La banane est écrasée afin de désagréger les tissus et de fragiliser les parois cellulaires. Puis on y rajoute du sel, ce qui permet d'éliminer les molécules d'eau associées à l'ADN et facilitera son isolation. On ajoute ensuite du liquide vaisselle.
Le sel facilite le broyage et augmente la dissolution de l'ADN. Avec la pipette compte-goutte, ajouter alors quelques gouttes de liquide vaisselle et bien mélanger (toujours avec le pilon). Le liquide vaisselle contient des substances qui détruisent les membranes des structures cellulaires.
L'échantillon contenant l'ADN est ajouté à une colonne contenant un gel de silice ou des billes de silice et des sels chaotropes. Les sels chaotropes perturbent la liaison hydrogène entre les brins et facilitent la liaison de l'ADN à la silice en rendant les acides nucléiques hydrophobes.
Pour pouvoir isoler l'ADN des tissus et des cellules, on procède à son extraction. Ce procédé est utile pour des recherches en biologie moléculaire, telles que le séquençage d'ADN, le PCR ou encore le clonage.
Le séquençage de l'ADN constitue une méthode dont le but est de déterminer la succession linéaire des bases A, C, G et T prenant part à la structure de l'ADN. La lecture de cette séquence permet d'étudier l'information biologique contenue par celle-ci.
La «Polymerase Chain Reaction» ou PCR (ou encore ACP pour Amplification en Chaîne par Polymérase), est une technique de réplication ciblée in vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'ADN spécifique et de longueur définie.
Les unités de base et de sucre (sans phosphate) sont appelées nucléosides. Les résidus de phosphate sont hydrophiles en raison de leur charge négative; ils donnent à l'ADN en solution aqueuse une charge globalement négative.
Le sucre (ou ose, plus précisément ici un pentose) présent dans l'ADN est le β-D-2'-désoxyribose. Le préfixe « désoxy » signifie qu'il y a un groupe hydroxyle (-OH) en moins. En fait, sur la position 2 de tous les sucres composant l'ADN, l'hydroxyle est remplacé par un atome d'hydrogène (H).
Une découverte qui a marqué l'histoire
Pour cette structure de l'ADN, Watson, Crick et Wilkins ont obtenu en 1962 le prix Nobel de physiologie ou médecine. Cette découverte a depuis marqué les esprits, certes du fait de son importance en tant que telle, mais aussi pour la « simplicité » des concepts découverts.
La filtration permet de retenir les débris cellulaires et les morceaux de tissus non désagrégés. Prélever 3 ml de filtrat et les transférer dans un tube 12 ou 15 ml. En inclinant le tube, ajouter délicatement 8 ml d'alcool à bruler.
Les lésions ainsi générées sont de natures très diverses : bases altérées ou perdues, liens intra – ou inter-brins, dimères de thymines, cassures simple ou double brin (Fig. 1). Les différentes lésions de l'ADN sont causées par une grande variété d'agents.